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凝膠色譜柱使用秘籍大公開,實驗成功率飆升!

更新時間:2025-03-12瀏覽:31次
  凝膠色譜柱是一種常用的分離技術,廣泛應用于生物學、生物化學、藥學、食品科學、環(huán)境監(jiān)測等多個領域。通過凝膠顆粒來實現(xiàn)樣品分離。凝膠顆粒根據其物理化學性質選擇性地固定不同的化合物,從而實現(xiàn)樣品的分離和純化。其分離機理主要包括凝膠顆粒的吸附和分子篩效應。凝膠顆粒表面的功能基團能夠與化合物發(fā)生作用,形成化學鍵,使其被固定在凝膠上。當樣品通過凝膠色譜柱時,分子會根據其不同的分子大小、電荷、親疏水性等物理化學性質在凝膠顆粒表面逗留時間不同,從而實現(xiàn)分離和純化。
  凝膠色譜柱的使用涉及多個關鍵步驟和注意事項,以確保實驗的準確性和重復性。以下是一些使用凝膠色譜柱的技巧:
  1、凝膠的選擇
  根據樣品性質選擇:如果分離的是水溶性物質,如蛋白質、核酸、多糖等大分子,一般選擇Sephadex G系列或Bio-Gel P系列等親水的凝膠;如果是分離有機溶劑中的有機物,則選擇適合有機溶劑的凝膠,如交聯(lián)聚苯乙烯凝膠用于凝膠滲透色譜(GPC)。
  考慮分子量范圍:不同的凝膠有不同的排阻極限和分級范圍。例如,Sephadex G-25適合分離分子量小于5000的小分子物質,而Sephadex G-200則可用于分離分子量較大的物質。要根據待分離樣品的分子量大小來選擇合適的凝膠型號。
  2、凝膠柱的制備
  溶脹處理:商品凝膠通常是干燥的顆粒,使用前需要將其在洗脫液中充分溶脹。一般在沸水浴中將濕凝膠逐漸升溫至近沸,可以縮短溶脹時間至1-2小時。溶脹一定要完q,否則會導致色譜柱不均勻。
  裝柱方法:裝柱時要確保凝膠填充均勻。可以先在柱內裝入約1/3高度的水或緩沖液,然后將溶脹好的凝膠在攪拌成稀漿的情況下慢慢倒入柱內,使其自然沉降,如此連續(xù)操作,得到均勻的柱床。也可以采用水浮選法去除凝膠中的單體、粉末及雜質,并用真空泵抽氣排出凝膠中的氣泡。
  柱均勻性檢查:裝填好凝膠柱后,需要進行均勻性檢查??梢栽谥苑乓黄叫械娜展鉄?,用肉眼觀察柱內是否有“紋路”或氣泡;也可以向色譜柱內加入有色大分子等,如果觀察到柱內譜帶窄、均勻、平整,說明色譜柱性能良好;如果色帶出現(xiàn)不規(guī)則、雜亂、很寬時,需要重新裝填凝膠柱。
  3、加樣技巧
  樣品處理:樣品應先經過過濾或離心,去除其中的固體顆粒,以免污染色譜柱。對于高濃度樣品,應進行稀釋后再進樣,以降低背景干擾。同時,要注意控制樣品的體積,一般不超過色譜柱床體積的1%-5%。
  上樣方式:上樣時要將樣品緩慢地沿著柱壁加入到凝膠柱的表面,避免破壞凝膠表面??梢允褂瞄L嘴滴管或微量注射器進行上樣,使樣品能夠均勻地分布在凝膠表面。
  4、洗脫與檢測
  洗脫劑選擇:洗脫劑的選擇要根據樣品的性質和凝膠的類型來確定。一般來說,要選擇與樣品和凝膠都相適應的洗脫劑,既能有效地洗脫樣品,又不會對凝膠造成損害。同時,洗脫劑的流速也要適當,過快會導致分離效果不佳,過慢則會延長分析時間。
  檢測方法:常用的檢測方法有紫外檢測、示差折光檢測等。在使用檢測器時,要根據樣品的性質和檢測要求選擇合適的檢測波長和檢測參數(shù),以提高檢測的靈敏度和準確性。
  5、色譜柱的維護與保養(yǎng)
  防止微生物生長:對于長時間使用的凝膠柱,要防止微生物的生長??梢栽谙疵搫┲屑尤脒m量的防腐劑,如疊氮鈉等,或者定期用適當?shù)南緞_洗色譜柱。
  避免壓力沖擊:在使用過程中要避免色譜柱受到壓力的沖擊,如突然升高或降低壓力可能會導致凝膠床的結構發(fā)生變化,影響分離效果。因此,在使用泵時要設置合適的壓力和流量,并且在操作過程中要避免色譜柱的堵塞。
  定期清洗:每次使用完色譜柱后,要及時進行清洗。先用對被測樣品洗脫能力強的溶劑將吸附在柱內的樣品洗脫下來,然后再用適當?shù)娜軇_洗色譜柱,以去除殘留的樣品和雜質。
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