反相色譜柱是指利用非極性的反相介質(zhì)為固定相，極性有機溶劑的水溶液為流動相，根據(jù)溶質(zhì)極性(疏水性)的差別進行溶質(zhì)分離與純化的洗脫色譜法。與HIC一樣，RPC中溶質(zhì)也通過疏水性相互作用分配于固定相表面，但是，RPC固定相表面*被非極性基團所覆蓋，表現(xiàn)出強烈的疏水性。因此，必須用極性有機溶劑(如甲醇、乙腈等)或其水溶液進行溶質(zhì)的洗脫分離。

　　反相色譜柱在使用前，醉好進行柱的性能測試，并將結(jié)果保存起來，作為今后評價柱性能變化的參考。在做柱性能測試時要按照C4反相色譜柱出廠報告中的條件進行（出廠測試所使用的條件是醉佳條件），只有這樣，測得的結(jié)果才有可比性。但要注意：柱性能可能由于所使用的樣品、流動相、柱溫等條件的差異而有所不同。

　　1、樣品的前處理

　　①醉好使用流動相溶解樣品。

　?、谑褂妙A(yù)處理柱除去樣品中的強極性或與柱填料產(chǎn)生不可逆吸附的雜質(zhì)。

　?、凼褂?.45μm的過濾膜過濾除去微粒雜質(zhì)。

　　2、流動相的配制

　　液相色譜是樣品組分在柱填料與流動相之間質(zhì)量交換而達到分離的目的，因此要求流動相具備以下的特點：

　?、倭鲃酉鄬悠肪哂幸欢ǖ娜芙饽芰ΓＷC樣品組分不會沉淀在柱中（或長時間保留在柱中）。

　　②流動相與樣品不產(chǎn)生化學反應(yīng)c、流動相的黏度要盡量小，以便得到好的分離效果;降低柱壓降，延長泵的使用壽命（可運用提高溫度的方法降低流動相的黏度）。

　?、哿鲃酉嗟奈锘再|(zhì)要與使用的檢測器相適應(yīng)。如使用UV檢測器，醉好使用對紫外吸收較低的溶劑配制。

　　④流動相沸點不要太低，否則容易產(chǎn)生氣泡，導致實驗無法進行。

　?、拊诹鲃酉嗯渲坪煤?，一定要進行脫氣。除去溶解在流動相中的微量氣體既有利于檢測，還可以防止流動相中的微量氧與樣品發(fā)生作用。

　　3、流動相流速的選擇

　　因柱效是柱中流動相線性流速的函數(shù)，使用不同的流速可得到不同的柱效。對于一根特定的C4反相色譜柱，要追求醉佳柱效，醉好使用醉佳流速。對內(nèi)徑為4.6mm的C4反相色譜柱，流速一般選擇1ml/min，對于內(nèi)徑為4.0mm柱，流速0.8ml/min為佳。

　　當選用醉佳流速時，分析時間可能延長?？刹捎酶淖兞鲃酉嗟南礈鞆姸鹊姆椒ㄒ钥s短分析時間（如使用反相柱時，可適當增加甲醇或乙腈的含量）。