疏水色譜柱是利用樣品分子與固定相的疏水力作用的不同，用流動相洗脫時，各組分遷移速度不同而達到分離的目的。流動相一般為pH 6-8的鹽水溶液，具有對蛋白質(zhì)的回收率高，蛋白質(zhì)變性可能性小等優(yōu)勢。由于流動相中不使用有機溶劑，也有利于蛋白質(zhì)保持固有的活性。

 

疏水層析的原理*不同于離子交換層析或凝膠過濾層析等技術，使該技術與后兩者經(jīng)常聯(lián)合使用來分離復雜的生物樣品。目前該技術主要應用領域是在蛋白質(zhì)的純化方面，成為血清蛋白、膜結(jié)合蛋白、核蛋白、受體、重組蛋白等，以及一些藥物分子，甚至細胞等分離時的有效手段。

 

疏水色譜柱的影響因素有哪些？

 

1、鹽類和鹽組成

鹽的摩爾表面張力增大，蛋白質(zhì)在疏水層析柱內(nèi)的吸附能力相應增大。各種鹽離子和離子對具有破壞周圍水分子有序排列的能力。 流動相中鹽的組成對蛋白質(zhì)在疏水層析介質(zhì)上的吸附能力具有為重大的影響。選擇合適的鹽對保證蛋白質(zhì)的分離以及分離后蛋白質(zhì)的活性都很重要。硫酸銨、醋酸銨、氯化鈉和磷酸鹽是疏水層析分離常用的幾種鹽。

 

2、離子強度

離子強度的大小直接影響樣品組分在固定相的保留值。一般增加離子強度來增加組分的保留值，降低離子強度來提高組分的解析附能力。

HIC實驗中，改變離子強度進行洗脫的方式，一般宜采用梯度洗脫法，可提高分離的選擇性。

 

3、溶液的酸堿度

溶液的pH值主要考慮能維持生物大分子生物活性的pH環(huán)境。一般情況，溶液的pH接近蛋白質(zhì)的等電點，其疏水性增加，有利于與固定相配基相互作用；遠離其等電點，其疏水性減少，不利于與固定相配基結(jié)合，但有利于蛋白質(zhì)洗脫。因此通過改變?nèi)芤旱膒H也可以改變蛋白質(zhì)的疏水性。

 

4、柱溫

一般柱溫升高，生物大分子的構(gòu)象會發(fā)生變化，疏水作用增加，吸附能力增加，有利于提高層析柱的分離度，所以有時可以通過提高柱溫來增加疏水基團與配基間的相互作用，分離性質(zhì)相近的化合物，如對分離一些小分子是非常有效的。但是對于具有生物活性的物質(zhì)或酶類，在高溫條件下易變性失活，因此不宜在高溫條件下進行分離。一般都在常溫或低溫下操作。